Targeting RuvBL1 hampers NASH-HCC progression by tipping the scale from mTOR-driven lipogenesis to AMPK-induced lipolysis.

RuvBL1 appartiene a una famiglia di ATPasi altamente conservate e associate a numerose attività cellulari (AAA+) tra cui la riparazione del danno al DNA, l’assemblaggio della telomerasi e la regolazione del pathway di mTOR. RuvBL1 è up-regolata in molti tumori umani e la sua espressione correla con una prognosi peggiore nei pazienti con HCC. In uno studio precedente abbiamo dimostrato che l’aploinsufficienza di RuvBL1 influenza il signalling dell’insulina deregolando il pathway del PI3K/Akt/mTOR. Considerata la rilevanza dell’iperattivazione di questo pathway nell’HCC, ipotizziamo che il targeting genetico di RuvBL1 possa ridurre la carcinogenesi mTOR-mediata nel modello murino transgenico Ptenhep-/-, che sviluppa NASH a 12 settimane di vita e progredisce spontaneamente in HCC con l’invecchiamento. Topi Ptenhep-/- e Ruvbl1hep+/- sono stati incrociati per generare topi Ptenhep-/-Ruvbl1hep+/-. La linea cellulare Pten-/- è stata ottenuta utilizzando il sistema di editing genetico CRISPR/Cas9 a partire dalle AML-12, una linea epatocitaria murina non-tumorale. Per confermare la delezione del locus Pten è stato effettuato il sequenziamento del DNA e verificata l’inattivazione di PTEN tramite Western blotting. L’effetto dell’aploinsufficienza di RuvBL1 sullo sviluppo della NASH è stato valutato tramite analisi istologiche effettuate su sezioni di fegato in topi di 12 settimane. I marker metabolici e infiammatori sono stati esaminati tramite qPCR e analisi immunoistochimica. Il pathway di mTOR è stato analizzato tramite WB di lisati estratti da fegato. Gli immunoprecipitati di RuVBL1 sono stati analizzati tramite analisi proteomica in spettrometria di massa. L’attività trascrizionale di PPARalpha è stata valutata tramite saggio reporter con la luciferasi. La traslocazione di TFEB nel nucleo è stata valutata mediante immunofluorescenza. L’identificazione di proteine associate a RuvBL1 è stata ottenuta tramite analisi proteomica in spettrometria di massa degli immunoprecipitati di RuvBL1 su linee epatocitarie murine e umane. L’aploinsufficienza di RuvBL1 sullo sviluppo dell’HCC è stato analizzato tramite valutazione macroscopica delle masse tumorali e la classificazione istologica è stata effettuata mediante il sistema di grading Edmonson-Steiner in topi a 15 mesi di età. La marcatura con Oil red, Sirius red e F4/80 ha rivelato una significativa riduzione di steatosi, fibrosi e infiammazione nei topi Ptenhep-/-Ruvbl1hep+/-. Valutando l’espressione genica tra i due modelli murini è stata riscontrata, contrariamente alle nostre aspettative, una simile espressione di mRNA dei principali geni lipogenici target di mTOR tra cui PPARgamma. È stato invece riscontrato un incremento dell’espressione di geni lipolitici quali Ppara e del suo target CPT1A nei topi Ptenhep-/-Ruvbl1hep+/-, suggerendo quindi che PPARalpha possa favorire il catabolismo lipidico in questo modello murino. Inoltre, esperimenti reporter sul promotore di PPARalpha hanno rivelato che l’inibizione dell’attività di RuvBL1 indotta dal CB-6644 incrementa l’attività trascrizionale di PPARalpha nelle AML-12. Contemporaneamente anche l’inibizione farmacologica di RuvBL1 ha dimostrato un decremento significativo dell’accumulo di grasso in linee Pten-/- trattate con il CB-6644 rispetto al controllo. Successivamente, l’analisi proteomica in MS degli immunoprecipitati di RuvBL1 effettuata in linee cellulari murine Hepa1-6, ha mostrato che RuvBL1 interagisce con una serie di membri del complesso di attivazione lisosomiale dell’AMPK quali V-ATPase, LAMTOR1, LAMTOR4, Rag C. Inoltre, è stato riscontrato un incremento dell’espressione di p-AMPK e pACC2 nei topi Ptenhep-/-Ruvbl1hep+/- rispetto ai topi Ptenhep-/- suggerendo un ruolo strategico di RuvBL1 nell’interazione tra il pathway di mTOR e quello dell’AMPK nel regolare il metabolismo lipidico epatico. Nella linea epatocitaria ottenuta in vitro, AML-12 PTEN KO, è stato riscontrato sia un incremento della traslocazione nucleare di TFEB e quindi una sua maggiore attività, sia un incremento dell’attività trascrizionale di PPARalpha, target di TFEB a seguito dell’inibizione farmacologica di RuVBL1 indotta dal CB6644. Infine, l’aploinsufficienza di RuvBL1 conferisce un vantaggio di sopravvivenza nei topi a 15 mesi d’età. Infatti, i topi Ptenhep-/-Ruvbl1hep+/ sviluppano meno masse di HCC e di grado inferiore rispetto ai topi Ptenhep-/-. Le analisi di qPCR hanno mostrato un aumento significativo di geni lipolitici quali Cpt1a, Acadl, Acadvl e Ppara, nei topi Ptenhep-/-Ruvbl1hep+/ rispetto ai topi Ptenhep-/-, confermando i dati dello stesso modello murino a 12 settimane d’età. In conclusione, i risultati ottenuti mostrano che il targeting di RuvBL1 mitiga sia il fenotipo metabolico della NASH che quello tumorigenico dell’HCC indotti dall’iperattivazione del pathway di mTOR nei topi Ptenhep-/-, probabilmente promuovendo lo switch dalla lipogenesi mediata da mTOR verso il catabolismo lipidico indotto dall’attivazione dell’AMPK.